RAPD-PCR 操作过程中应注意的事项

RAPD-PCR 是超微量操作，在 25μL 的反应体系中要加入 6 种成分，由于自动移液器质量不好或移液枪头不规范引起的加样或取样时的任何微小误差都会造成大的误差，因此为了减少误差、简化操作，在实验过程中采取了配制混合液的方法，在用同一引物扩增时，每个样品只加两次样，先加混合液，再加 DNA 模板，轻轻涡旋混匀样本，短暂离心，这样避免了繁琐的加样操作所带来的误差。引物、dNTP、29Mg2+要充分溶解并混匀后使用，而 Taq-DNA 聚合酶易降解失活，因此在配制混合液时应先加入其它组分，另外，室温下配制 RAPD-PCR 物理反应混合物时，Taq-DNA聚合酶具有的少量活性可引发非特异性事件，如错配或形成引物二聚体，并最终引起 PCR 时的非特异性扩增，因此 PCR 反应混合物配制须在冰上操作。配制的混合物要足量。
引物、DNA 模板等要配制一定浓度的使用液，稀释好的模板 DNA 可放入 4℃冰箱中保存，将剩余部分引物和 DNA 的原溶液置于-20℃冰箱中储存备用，这样可以避免实验过程中因反复冻融而引起的生物大分子被破坏以及对原液的污染。5.3 PCR 反应体系对扩增效果的影响引物、Taq-DNA 聚合酶、Mg2+、dNTP 等量的多少都可能会对 RAPD-PCR 扩增效果产生一定的影响，所以优化好反应体系中每个因子的反应参数是保证扩增效果的前提。当因素之间有交互作用时，必须采用可考察因素间交互作用的实验设计，正交设计因其“整齐可比，均匀分散”而被广泛应用。
模板浓度在一个相当大的范围内不影响扩增结果，而模板的降解程度会影响 RAPD 的结果。只要模板 DNA 浓度在一定范围内，则对于扩增的条带多态性影响不会太大，主要是条带的亮弱可能会有所不同，本实验在优化体系时发现不同模板 DNA 的量扩增结果相近，符合以上结论。为减小因微量操作引起的误差，本实验中模板 DNA 的量最后确定为 30ng；RAPD 反应常用的引物浓度为0.1~1μmol/L ，引物浓度偏高会引起错配和非特异性扩增，故本实验采用了0.4μmol/L；dNTP 是 PCR 扩增必不可少的元素之一，在 PCR 反应中，dNTP 一般在0~300μmol/L 之间，浓度偏高容易引起错配，浓度过低又会使 dNTP 与 Mg2+结合，使游离的 Mg2+浓度降低，从而降低 PCR 产物的产量，但本实验设置的 dNTP 浓度在 0.2~0.5mmol/L 时，均可扩增出条带，且条带基本一致，仅个别弱带出现差异，这与有些物种进行 RAPD 分析时 dNTP 的浓度对扩增效果影响不大结论一致。
故本实验中采用了 0.2mmol/L；Mg2+对 PCR 扩增的特异性和产量有显著的影响，在一般的PCR反应中，dNTP浓度为0.2~0.3mmol/L之间时，Mg2+浓度为1.5~2.0mmol/L为宜，Mg2+浓度过高，反应特异性降低，出现非特异扩增，浓度过低会降低 Taq-DNA聚合酶的活性，使反应产物减少，Buffer 与 Mg2+二因素的交叉实验也是证明了 Mg2+对扩增的重要影响，确定扩增反应的最佳 Mg2+浓度非常重要。为了避免因 Mg2+浓度过高而产生非特异性条带，本实验选择 Mg2+的浓度为 2.0mmol/L，Buffer 缓冲液使用含有 Mg2+的，用量为 2.5μL。