PCR 扩增产物特异性的确定

PCR 产物经单一熔解曲线峰进行确定，并取 6 μl Real Time PCR 产物经 2%琼脂糖凝胶电泳（100 V，10 min）确定扩增产物片段大小后，送交上海生工进行序列测定。实时荧光定量 PCR 扩增效率以及扩增和熔解曲线的绘制将 cDNA 倍比稀释 10 倍，进行实时荧光定量 PCR,反应体系及运行程序如同检测 ghrelin 基因和 GAPDH 基因的 PCR 扩增效率。
Ghrelin 和 GAPDH 的扩增曲线和熔解曲线是有实时荧光定量 PCR 程序结束后仪器自动形成的。为了验证ghrelin 和 GAPDH 是都确实可以利用 2-ΔCT公式进行目的基因在组织中相对表达量的计算。将小鼠各个时期胚胎细胞的 cDNA 以 10 倍的梯度进行稀释分别作为模板，进行 ghrelin 和 GAPDH 实时荧光定量 PCR 检测。用得出的 Ct 值绘制扩增曲线图。
Ghrelin、GAPDH 相对表达量计算方法的测定原理。本实验采用的是 SYBR Green I 荧光染料法进行实时荧光定量 PCR 反应的检测。SYBR Green I 是一种能与双链 DNA 结合发光的荧光染料，当其与双链 DNA 结合后荧光大大增强；从 DNA 双链上释放出来时，荧光信号急剧减弱。聚合完成之后，SYBRGreenI 染料与双链产物结合，定量 PCR 系统检测到荧光的净增量加大。因此其荧光定量的信号强度与双链 DNA 的数量有关，可以根据荧光信号强度检测出 PCR 体系中存在的双链 DNA 数量。但是，一旦 SYBR 处于游离状态下，它不发出荧光。这样可以与任意引物或模板结合用于任何反应体系，比探针要经济实惠很多，但是唯一不足的地方是一旦反应体系中出现非特异扩增，就会影响到定量结果的可靠性。熔解曲线能够鉴定 PCR 产物的特异性，PCR 产物是特异性是有 Tm 值处出现单一的曲线峰值来确定的，而非特异性产物会形成多个分离的曲线锋。Ct（thresholdcycle）值是实时荧光定量 PCR 技术中进行定量的一个重要参数，是指反应体系中的荧光信号达到设定阈值时所经历的循环数，每个模板的 Ct 值与该模板的起始拷贝数的对数存在着线性关系，在反应的起始，模板数越高，需要越少的循环数达到荧光信23号阈值，即起始拷贝数越多，Ct 值越小。此时需要的循环数即使 Ct，它总是出现在扩增的指数期。因此，定量过程不受反应组成的影响，而主要取决于反应体系的底物浓度。通过标准曲线，可对要扩增基因的浓度进行准确定量。在 RT-PCR 中由于不同的样品在逆转录过程中的效率存在一定的差别，因此需要设计表达水平相对较为稳定的内参基因来对结果进行标准化。