电融合获得四倍体胚胎及发育能力比较

多倍体发育现象在植物界以及无脊椎动物中普遍存在,但在哺乳动物中多倍体经常在胚胎发育的早期或者出生后不久就死亡了仁.]"自发形成四倍体的机率非常低,这主要是由于受精卵在第一次卵裂时细胞质分裂失败造成的"小鼠自然发生的几率仅有0.1%=2一3],染色体不正常造成自发流产的胎儿中约有1.1一7.1%是染色体加倍造成的阵,表现为只有胚外组织而没有胎儿本身[s]"人工诱导四倍体技术己经成为实验室的常规技术,为研究染色体加倍后生命活动现象提供了宝贵的材料"目前,四倍体胚胎主要通过化学法!生物法!物理法来制备"电融合的原理是在紧密相连的卵裂球接触面上垂直施加一定强度的脉冲,在短时间内使细胞质膜发生可逆转性的电穿孔,相邻的卵裂球细胞膜发生融合,从而染色体加倍后即可得到四倍体"这种制备四倍体的方法原来在植物中应用"克服了潜在的化学试剂的毒害和病毒致病性的干扰,而且对胚胎细胞损伤较小,胚胎发育能力更强,已经成为制作四倍体胚胎最常用的方法"
本实验就采用电融合的方法获得四倍体胚胎"对昆明小鼠的2细胞期胚胎进行卵裂球电融合,比较了不同电压参数对融合率和4N囊胚率的影响,为四倍体补偿技术生产转基因小鼠奠定基础".
1材料
实验动物昆明小白鼠由内蒙古大学国家清洁级实验动物繁育室提供"本实验中所用的小鼠均为6一8周龄"昆明小白鼠用作四倍体囊胚的供体和制备假孕母鼠"
2主要试剂及耗材
孕马血清促性腺激素(PMSG)和人绒毛膜促性腺激素(hCG)为宁波市三生药业有限公司生产,透明质酸酶(Hyaluronidase,sigma),石蜡油(51脚a)"KsoM+AA(milliPore公司生产),MZ和融
合液为自行配制(所使用的药品均购自日本和光工业株式会社)"无菌手术器械(眼科剪子!手术镊子和手术刀等)!进口培养皿35mm(coming)!lml注射器等"融合仪采用BTXECM2001"
主要溶液的配制:孕马血清促性腺激素(PMSG):用IOml生理盐水稀释一支1000IUPMSG,分装保存于一20e冰箱"人绒毛膜促性腺激素(hCG):用50ml生理盐水稀释一支SO00IUhCG,分装保存
于冰箱"透明质酸酶(Hyaluronidase,51脚a)(2.smg/mlstoek):loomg粉剂溶解于4omlpBS(pll7.4)溶液中"融合液:(一)Mgso4#7HZO(looX)0.02469/10ml(二)soml六蒸水中+甘露醇
(mannitol)2.73259+pVAsmg+BsA0.159,把配好的(一)溶液加o.sml到(二)溶液中,o.22um滤器过滤,分装,一20e保存备用"
2方法
2.1合子的采集
8周龄的性成熟的昆明小白鼠于下午5:00腹腔注射PMsG10饥(8:oo一20二00光照),48h后腹腔注射hCG10UI,以1:l的比例与雄鼠合笼"次日清晨检查阴道栓,见栓当天,颈椎脱臼法处死母鼠后取出输卵管,置于添加0.1%透明质酸酶的MZ采卵液中,撕开输卵管膨大部,可以看到包裹着大量卵丘细胞的受精后合子呈团状聚集在一起,透明质酸酶消化3一smin后,卵丘细胞脱落,迅速将合子从透明质酸酶中移到MZ采卵液,洗三遍后,除去残留的透明质酸肖红小鼠四倍体补偿技术的初步探讨酶,将形态良好的合子挑出,置于KSOM发育微滴中(50ul),37e!5%CO:条件下过夜培养备用"
2.2电融合获得四倍体胚胎
次日,挑选形态正常的2一细胞期胚胎进行电融合,融合液为03mol/L甘露醇溶液(含0.3%BSA),交流电(1一ZV)排序,待胚胎两分裂球的接触面与电场方向垂直时,开始电融合,设置30v!SOv!100V直流电压,脉冲时程35娜,脉冲次数2次,融合过的二细胞用MZ洗涤两次后移入KSOM液中培养,lh后统计融合率,融合胚24h后发育至4一细胞阶段,48h后发育至囊胚阶段"
3结果
3.1电融合获得四倍体囊胚的条件本实验对不同融合电压处理条件下2一细胞期胚胎融合情况及囊胚发育能力进行摸索比较"在脉冲时程!脉冲次数一定的前提下,分别采用30V!50V!looV三种直流电压,结果如表1所示,50V电压下2一细胞的融合率最高,相比30V电压下的融合率有显著差异(P<0.05),相比100V电压下的融合率无显著差异(P>0.05):而50V电压下的四倍体囊胚率相比30V电压下的四倍体囊胚率无显著差异(P>0.05),与looV电压下的四倍体囊胚率相比显著差异(P<0.05)"各时期胚胎发育情况见图版一"综合融合率和囊胚率两组数据分析得出,SOV电压下的融合率和囊胚率是最优组合,因此在本实验条件下电融合获得四倍体囊胚的最佳融合条件为交流电(l一ZV),直流电50V,脉冲时程35林S,脉冲次数2次"。